Meccanismo della Ricombinazione Guidata dall’RNA Ponte
Preparazione di Proteine e RNA
Il gene della ricombinasi IS621 è stato clonato in un vettore di espressione modificato e espresso in cellule Sf9 con il sistema Bac-to-Bac. Le proteine IS621, S241A e D11A/E60A/D102A/D105A sono state purificate tramite varie fasi di lavorazione e cromatografia.
Le cellule Sf9 contenenti la proteina espressa sono state lisate mediante sonicazione e il lisato chiarificato. Successivamente, la proteina è stata eluita e purificata tramite cromatografia su colonna. I bRNA sono stati trascritti in vitro con la polimerasi T7 RNA e purificati con PAGE denaturante.
Preparazione del Complesso Sinaptico
Il complesso sinaptico IS621–bRNA–dDNA–tDNA è stato ricostituito mescolando la ricombinasi IS621 purificata con bRNA, dDNA e tDNA in specifici rapporti molari. Sono stati introdotti disallineamenti selettivi per ottenere diversi stati di scambio nel complesso sinaptico.
Il complesso sinaptico è stato purificato mediante cromatografia su colonna e la frazione di picco contenente il complesso è stata concentrata. Le concentrazioni proteiche sono state misurate per l’analisi successiva.
Analisi Crio-EM
Le griglie sono state scaricate a bagliore in aria a bassa pressione con una corrente di 10 mA. La soluzione del complesso sinaptico è stata applicata a una griglia Quantifoil Holey Carbon Grid. Il campione è stato trattato nel microscopio crioelettronico per le analisi strutturali.## Tecnica di imaging tramite microscopio elettronico
Un sistema Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato a 4 °C con un tempo di attesa di 10 s e tempo di assorbimento di 6 s, in condizioni di umidità al 100%. Le griglie, contenenti il complesso sinaptico con diversi tipi di bRNA, sono state congelate in etano liquido raffreddato all’azoto liquido.
## Microscopia elettronica ad alta risoluzione
Le griglie sono state trasferite a un microscopio elettronico Titan Krios G3i o G4 (Thermo Fisher Scientific) operante a 300 kV, dotato di Gatan Quantum-LS Energy Filter (GIF) e Gatan K3 Summit Direct Electron Detector. L’immagine è stata acquisita con un ingrandimento nominale di 105.000 × e una dimensione pixel di 0,83 Å.
## Elaborazione dati tramite cryoSPARC
I dati acquisiti sono stati elaborati utilizzando il software cryoSPARC v4.3.0. Dopo l’allineamento e la correzione del movimento, i parametri CTF sono stati stimati. Le particelle sono state selezionate automaticamente e curate mediante raffinamenti successivi, ottenendo mappe con risoluzioni di 2,58 Å e 2,52 Å, secondo il criterio FSC = 0,143.
## Analisi dettagliata dei complessi sinaptici
Per ciascun tipo di bRNA, le particelle sono state selezionate, curate e raffinate in modo specifico. Il processo ha prodotto mappe con risoluzioni di 2,58 Å per il bRNA WT e 2,79 Å per il bRNA pre-HSB. La correzione del movimento locale ottimizzata ha contribuito alla precisione dei risultati.
## Conclusioni da cryoSPARC
L’impiego di cryoSPARC ha consentito un’analisi dettagliata dei complessi sinaptici con diversi tipi di bRNA, fornendo mappe ad alta risoluzione utili per lo studio strutturale. Questo metodo combinato di imaging e analisi dati si è dimostrato prezioso per la comprensione delle interazioni molecolari a livello sinaptico.
Analisi strutturale tramite criomicroscopia elettronica
La risoluzione della mappa del complesso sinaptico è stata ottenuta a 2,72 Å mediante il calcolo del criterio FSC = 0,143. La risoluzione locale è stata stimata utilizzando BlocRes in cryoSPARC.
Selezione e raffinamento delle particelle
Le particelle del complesso sinaptico bRNA post-HSB sono state automaticamente selezionate e classificate senza riferimenti. Successivamente, sono state affinate tramite raffinamento omogeneo e eterogeneo. Ulteriori classificazioni 3D hanno permesso di distinguere l’eterogeneità conformazionale.
Costruzione e convalida del modello
I modelli del complesso sinaptico sono stati costruiti manualmente con COOT, perfezionati con phenix.real_space_refine e Servalcat utilizzando mezze mappe non affilate. La validazione è stata condotta con MolProbity e le statistiche riassunte in una tabella.
Saggi di ricombinazione in vitro
Per i test in vitro, substrati lineari di tDNA e dDNA sono stati sintetizzati e marcati con FAM o Cy5. I substrati sono stati miscelati con il complesso IS621-bRNA e le reazioni sono state incubate. I campioni sono stati analizzati con urea-PAGE e i segnali fluorescenti registrati.
Termoforesi su microscala
Esperimenti di termoforesi su microscala sono stati condotti utilizzando un’apposita strumentazione. La ricombinasi IS621 è stata marcata e testata per valutarne l’affinità per l’RNA. I dati sono stati analizzati tramite un apposito software.
Test di ricombinazione batterica
Sono stati condotti test di ricombinazione batterica utilizzando cellule BL21(DE3) co-trasformate con plasmidi pTarget e pDonor, per attivare l’espressione di GFP dopo la ricombinazione del DNA. Le colonie sono state analizzate tramite citometria a flusso per valutare l’espressione di GFP.
Analisi di covariazione
È stata eseguita un’analisi di covariazione per individuare i potenziali accoppiamenti tra il bRNA e il tDNA o dDNA. Sequenze IS621 sono state confrontate con un database di elementi IS110 per identificare omologhi della sequenza bRNA. Successivamente, sono stati analizzati gli accoppiamenti di nucleotidi tra le sequenze bersaglio-donatore e il bRNA.
Riepilogo della rendicontazione
Ulteriori dettagli sul disegno della ricerca possono essere consultati nel Nature Portfolio Reporting Summary collegato a questo studio scientifico. Questo riassunto fornisce informazioni dettagliate sulle metodologie utilizzate e sui risultati ottenuti durante l’esperimento.
